Penelitian dilakukan mulai bulan Januari sampai Desember 2010, di Laboratorium Biologi Molekuler-LRPI dan Lab. Kultur Jaringan, Kelti Plasma Nutfah dan Pemuliaan, serta kamar kaca, Balittro, Bogor.
Bahan tanaman yang digunakan adalah Jahe tahan media seleksi (filtrat R. solanacearum dan Acibenzolar S-methyl), jahe merah, semua bagian tanaman. Bahan kimia yang diperlukan adalah: N2 cair, CTAB (N-cetyl-N,N,N-trimethylammonium bromide) (Merck), trizma base (Sigma), PVP (polyvinyl pyrrolidone), larutan bufer tris-HCl 1 M pH8.0, larutan EDTA 0.5 M pH8.0, NaCl 5 Metanol 70%, isopropanol, ddH2O, etanol absolut, larutan kloroform : isoamilalkohol (CI) 24:1, natrium asetat 3 M pH5.2, loading bufer (Brom fenol biru 2.5%; sukrosa 40%), etidium bromida 1% (w/v), Agarosa, Axyprep DNA gel extraction kit (Axygen), Taq Polimerase (Bioron), Escherichia coli XL1-Blue, pGEM-T Easy vektor (Sigma), medium LB (Luria Bertani), High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche), T4 DNA ligase, X-Gal, IPTG dan Ampisilin. Peralatan yang digunakan antara lain, PCR (Biometra T-Personal), DNA speed vacum 110 savant, Eppendorf sentrifus 5417R, sentrifus beckman allegra 64R, Laminar air flow, inkubator bergoyang, pipetman Gilsan, pipet eppendorf, gel doc, deep freezer, vortex, bak elektroforesis gel agarosa, oven microwave, scapel, pinset, tabung ukuran 2000μL dan 50μL (Axygen).
Peneletian menggunakan metode eksperimental dengan tahapan kegiatan sebagaio berikut:
Disain Primer
Primer dirancang menggunakan program primer3 yang tersedia pada situs web http://frodo.mit.edu/. Hal pertama yang dilakukan dalam perancangan primer adalah memasukkan data urutan basa DNA target, urutan dapat diketahui dengan mencari data gen RRS1-R pada tanaman dikotil lain yang telah tersedia datanya di www.ncbi.nlm.nih.gov. Tanaman yang digunakan untuk merancang primer RRS1-R diantaranya yaitu Arabidopsis. Perancangan menghasilkan beberapa primer dengan ukuran perkiraan fragmen hasil PCR yang bervariasi. Setiap primer disusun sedemikian rupa agar memenuhi kriteria (Rozen dan Skaletsky, 1999). Hasil perancangan tersebut berupa urutan oligonukelotida dengan beberapa data yang penting untuk diketahui dalam pelaksanaan proses PCR, seperti; Tm (melting temperature), jumlah basa, kandungan GC dan yang lainnya.
Isolasi RNA Total
RNA total diisolasi dari sampel daun jahe dengan metode yang dikembangkan oleh Chaidamsari et al. (2005). Sampel sebanyak 1.5-2 g digerus sampai halus dalam mortar dengan bantuan N2 cair serta PVP 1.5 %, kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus yang berisi 15 ml buffer ekstraksi dengan suhu 65°C. Sebanyak 150 μl β-merkaptoetanol ditambah ke dalam tabung sentrifus lalu dikocok kuat hingga tercampur sempurna. Suspensi tersebut diinkubasi pada penangas air suhu 65°C selama 1 jam dan dikocok kuat setiap 15 menit. Setelah didiamkan pada suhu ruang selama 5 menit, suspensi diekstrak dengan 1V (satu kali volume) campuran kloroform : isoamilalkohol (CI, 24:1), dikocok perlahan, selanjutnya disentrifus pada kecepatan 15000 rpm selama 15 menit pada suhu 25°C.
Fraksi atas dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru, diekstrak dengan 1V fenol : kloroform : isoamilalkohol (PCI, 25:24:1), dan disentrifus dengan kondisi yang sama. Selanjutnya fraksi atas dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru dan diekstrak sebanyak dua kali dengan 1V CI. Setelah ekstraksi CI terakhir, fraksi bagian atas dipindahkan ke dalam tabung sentrifus baru dan ditambah LiCl 8 M hingga konsentrasi 2 M dan disimpan semalam pada suhu 4 °C. Setelah semalam, larutan disentrifus dengan kecepatan 12000 rpm selama 30 menit pada suhu 4 °C. Supernatan dibuang dan pelet dilarutkan dalam DEPC.ddH2O sebanyak 750 μl. Prosedur pengerjaan selanjutnya dilakukan pada kondisi dingin (dalam es). Larutan dipindahkan ke dalam tabung mikro dan diekstrak berulang dengan 1V fenol, PCI, CI, dan disentrifus pada 12.000 rpm, 15 menit, 4°C.
Fraksi atas diendapkan dengan 0.1 V Na-asetat (3M, pH 5.8) dan 3 V etanol absolut, selanjutnya disimpan dalam lemari pendingin selama 3 jam. Setelah itu larutan disentrifus kembali pada kecepatan 12000 rpm, 4 °C, selama 30 menit. Supernatan dibuang, pelet dicuci dengan etanol 70% dan disentrifus pada 12000 rpm, 4 °C, selama 5 menit. Kemudian, etanol dibuang dan pelet disentrifus kembali pada kecepatan 12000 rpm, 4 °C, selama 2 menit. Pelet dikeringanginkan beberapa saat untuk menghilangkan sisa etanol. Setelah itu pelet dilarutkan dalam 30 μl DEPC. ddH2O.
Sintesis First-Strand DNA
Sintesis utas pertama cDNA dilakukan menggunakan kit SuperScriptTM II Reverse Transcriptase (Invitrogen). Volume reaksi sebanyak 20 μL untuk setiap 1 ng sampai 5 μg total RNA. Proses pemanasan dan inkubasi dilakukan dengan mesin PCR (Biometra T-personal). Sintesis dilakukan dalam tabung mikro steril dengan komposisi 9 μL ddH2O, 1 μL 10 mM dNTP mix, 1 μg RNA total daun jahe dan 1 μ10 p mol/μL oligo (dT)23 (Ambion). Campuran tersebut dipanaskan pada 65 °C selama 5 menit dan setelah itu segera dimasukkan kedalam penangas es, kemudian ditambahkan 4 μL first strand buffer 5X dan 2 μL 0,1 M DTT. Dicampur dengan segera dan diinkubasikan pada 42 °C selama 2 menit. Kemudian ditambahkan 1 μL (200 unit) enzim SuperscriptTM II Reverse Transcriptase dan dicampur dengan pemipetan naik turun. Setelah diinkubasikan pada 42 °C selam 50 menit, reaksi dinonaktifkan dengan pemanasan 70 °C selama 15 menit, selanjutnya ditambahkan 1 μL (2 unit) RNase H dan diinkubasi pada 37 °C selama 20 menit. cDNA utas pertama yang terbentuk selanjutnya digunakan sebagai template untuk amplifikasi fragmen gen RRS1-R, menggunakan primer spesifik RRS1-R
Reverse Transcriptase-PCR
Template yang digunakan pada reaksi ini adalah first strand cDNA jahe total dan prosedur yang digunakan adalah Superscript TM II RT (Invitrogen) yang dimodifikasi. RT-PCR dilakukan dengan volume PCR mix 25 μL yang terdiri atas: 2,5 μL bufer komplit 10x, 1 μL dNTPs, 1 μL primer F, 1 μL primer R, 0,5 μL Taq polimerase, 1 μL template, 18 μL molecular water.
Amplifkasi RT-PCR menggunakan mesin PCR Biometra T-personal dengan program sebagai berikut: initial denaturasi 94 °C 5 menit dilanjutkan dengan denaturasi 94 °C selama 45 detik, annealing 50 °C selama 45 detik, ekstensi 72 °C selama 5 menit. Hasil amplifikasi diverifikasi pada gel agarose 1%.
Ekstraksi dan Purifikasi Amplikon dari Gel
Prosedur yang digunakan adalah Axyprep DNA gel extraction kit (Axygen). Pita DNA yang ukurannya sesuai dengan yang diharapkan selanjutnya diekstraksi dari gel.
Hasil ekstraksi diverifikasi sebanyak 2 μL pada gel agarose 1% dan jika positif, selanjutnya diligasi pada vektor kloning.
Kloning Fragmen DNA dari Gen RRS1-R dengan pGEM-T Easy
Hasil amplifikasi yang telah dimurnikan dengan menggunakan Axyprep DNA gel extraction kit (Axygen) disisipkan ke dalam vektor pGEM-T Easy (Promega) menggunakan T4 DNA ligase selama satu jam, 37 ºC. Vektor kemudian ditransformasikan ke dalam E.coli XL-1 Blue yang telah dibuat kompeten. Preparasi sel kompeten dikerjakan sesuai prosedur Okayama et al. (1990). Transformasi dilakukan mengikuti prosedur Doyle (1996). Campuran ligasi yang ditambahkan ke dalam 200 μL suspensi sel kompeten adalah 20 μL. Sel kemudian disebarkan diatas media padat LB agar yang mengandung antibiotik 100 mg/L ampisilin, 40 mg/L X-Gal, dan 0,1 mM IPTG (LA) kemudian diinkubasikan semalam pada suhu 37ºC.
PCR Koloni
Koloni yang terbentuk adalah sel E.coli yang berhasil ditransformasi. Sel yang tidak berhasil tertransformasi akan mati akibat adanya ampisilin. Dua jenis koloni akan terbentuk pada cawan petri. Koloni yang berwarna putih menunjukkan sel yang mengandung plasmid yang berhasil disisipi. Koloni yang berwarna biru mengandung plasmid yang tidak berhasil disisipi. Setiap koloni putih yang terbentuk diberi nomor dan ditandai. Koloni yang berwarna putih kemudian diambil sedikit dengan tusuk gigi untuk PCR koloni, sedikit dipindahkan ke medium LB agar dalam cawan petri, dan sisanya dimasukkan kedalam medium LB yang mengandung ampisilin cair untuk dikulturkan kembali semalam 37ºC, 150 rpm.
Minirep DNA Plasmid
Prosedur yang digunakan adalah High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche). Isolasi DNA plasmid dilakukan terhadap koloni yang berdasarkan hasil PCR koloni diketahui mengandung plasmid tersisipi fragmen yang diinginkan. Koloni tersebut dikulturkan dalam media LB+ampisilin cair semalam pada suhu 37ºC dan pengocokan 150 rpm. Kultur cair diberi label sesuai dengan label koloni masing-masing. DNA plasmid yang diperoleh diverifikasi pada gel agarose 1% untuk melihat kemurniannya.
Sequensing DNA
Sekuensing dilakukan di lembaga Eijkman-Jakarta. DNA disikuen menggunakan primer universal M13-F dan M13-R. Sikuen DNA yang diperoleh dianalisis dengan program bioinformatika.
Isolasi Full length gen RRS1-R
Fragmen gen yang telah terklon pada vector cloning dijadikan template untuk mendisain primer baru, yang akan digunakan pada RACE –PCR untuk isolasi full length. Prosedur untuk RACE-PCR terdapat pada manual. Full length didapatkan dari 5’RACE dan 3’ RACE. Fragmen yang didapatkan selanjutnya diklon pada vector cloning selanjutnya di sequence sesuai prosedur yang diuraikan di atas. Jika telah didapatkan full length gen RRS1-R selanjutnya diligasikan pada vector ekspresi dibawah promoter 35SCaMV. Selanjutnya ditransformasikan pada Agrobacterium tumefaciens yang selanjutnya akan ditransformasikan pada jahe putih untuk pembentukan varietas jahe putih besar berproduksi tinggi tahan penyakit layu.
Karakterisasi RRS1-R pada berbagai Jaringan Tanaman Jahe
Fragmen Jahe yang telah diketahui dan disekuensing selanjutnya dibuat rancangan primernya untuk RT-PCR. Jaringan yang akan dikarakterisasi untuk mengetahui keberadaan dari gen RRS1-R diisolasi RNAnya, jaringan yang digunakan diantaranya adalah akar, daun, rimpang. Isolasi dilakukan sesuai prosedur yang telah diuraikan sebelumnya. Selanjutnya hasil isolasi kembali dianalisis menggunakan PCR.
No comments:
Post a Comment